在第7天，HCP (M)、HCP (H) 和DDP 组的肿瘤体积较低（图2A ）。在第14天，HCP（M）和HCP（H）组的肿瘤体积显著低于其他组，并且随着剂量的增加，肿瘤体积有减小的趋势（图2B）。在第21天，HCP (H) 组的肿瘤重量和体积显著下降（图2C、D）。在治疗的21天期间，所有组的体重都有增加的趋势（图2E）。治疗21天后，HCP（H）组的体重变化明显低于对照组（图2F）。HCP（L）、HCP（M）、HCP（H）和DDP组在治疗后肿瘤抑制率（IRs）分别为6.51%、14.58%、29.38%和36.40%。治疗21天后，各组之间的肝脏或肾脏指标没有显著差异（图2G、H）。

解剖过程顺利，肿瘤可完全分离。可以清楚地区分肿瘤组织和周围组织。肿瘤质地较硬，边界清晰。模型组的体积高于其他组。切片并用H＆E染色后，癌细胞大且异形，细胞核大且染色强烈。模型组肿瘤细胞排列紧密，细胞核多，形态清晰。DDP组肿瘤细胞分布较松散，细胞相对较少。与模型组相比，HCP处理组异常细胞相对较少，细胞密度较松散（图2I）。观察各组肝组织切片。每组小鼠的肝小叶是完整的，肝细胞没有放大，细胞核定位在中间，细胞间隙清楚，而且没有明显的异常（图2J）。各组肾组织切片未见明显病理改变。肾小球中发生病变的膜细胞或内皮细胞没有增加（图2K）。

Western印迹表明HCP（H）组波形蛋白和N-钙粘蛋白水平显著低于模型组。HCP (M)、HCP (H) 和DDP组的蜗牛水平显著降低。HCP（H）和DDP组的E-钙粘蛋白水平增加（图3A、B）。蛋白质芯片数据表明 14 种蛋白质表现出差异表达（4 种下调和10种上调）（图3C）。上调的蛋白质之一是GREM1，它由GREM1基因编码，与癌转移密切相关。高通量测序揭示了1121个差异表达的基因（441个下调和680个上调）（图3D）。Rap1 信号通路表明，GREM1表达受 miR-205-5p 调节（图3E）。因此，HCP通过调节Rap1信号通路发挥抗肿瘤作用，GREM1是NSCLC转移的重要治疗靶点。

使用CCK-8测定评估GREM1对A549细胞增殖的影响。A549细胞中的OE-GREM1没有显著抑制或促进增殖（图4A）。用shGREM1转染A549细胞时，观察到相同的结果（图 5A）。使用伤口愈合和Transwell测定探索了GREM1对转移的影响。OE-GREM1显著增加了A549细胞的迁移和侵袭（图4B、C）。当用shGREM1转染A549细胞时，迁移和侵袭显着减少（图5B 、C）。这些数据证实GREM1促进了NSCLC细胞的转移，并没有显著增加细胞增殖。

为了进一步探索GREM1对转移影响的潜在机制，作者研究了其在EMT中的作用。随着GREM1表达的增加，间充质标志物（包括波形蛋白、Snail 和N-钙粘蛋白）的蛋白质水平显著增加。相比之下，上皮标志物E-钙粘蛋白的水平急剧下降（图4D）。在用shGREM1处理的A549细胞中，间充质标志物的表达被抑制，上皮标志物的表达显着增加（图5D）。因此，GREM1可能通过促进EMT进展来促进NSCLC的迁移和侵袭。作者进一步研究了Rap1相关信号通路组分（Rap1、c-raf 和 erk1/2）在NSCLC中响应GREM1的变化。结果发现GREM1过表达显著增加了Rap1通路中信号蛋白相关基因的表达（图4D），反之亦然（图5D）。因此，这些结果表明GREM1在Rap1通路的调节中起重要作用，并可能通过激活该通路促进NSCLC的转移。

图4 OE-GREM1通过Rap1途径调节EMT进展，促进A549细胞转移

图5 ShGREM1通过Rap1通路调节EMT进展来影响A549细胞的转移