佛山市妇幼保健院科研实验中心自成立以来，一直致力于共生微生物与肿瘤的基础研究及其临床应用转化。最近，本中心苏冀彦副研究员以第一作者身份在Gut Microbes（中科院一区，Impact factor：12.2）发表题为“Prevotella copri exhausts intrinsic indole-3-pyruvic acid in the host to promote breast cancer progression: Inactivation of AMPK via UHRF1-mediated negative regulation”的研究论文（通讯作者为实验中心主任夏承来研究员、广东省中医院陈前军教授以及广东省科学院微生物研究所谢意珍研究员）。此外，该研究成果已形成授权中国发明专利一项（专利号：ZL 2022 1 1572648.7）。（麦特绘谱提供个性化靶向定制检测服务）
在本论文中，我们首先发现乳腺癌患者肠道菌群的α-多样性和β-多样性也与良性乳腺疾病患者有显著差异。在构成该差异的特异性微生物物种中，Prevotella属的相对丰度和流行率均显著高于对照组患者，且其在65岁以下乳腺癌患者中的相对丰度和流行率仍显著高于对照组人群。已有文献报道， Prevotella copri是Prevotella属中最为常见的一个种，也广泛存在于人肠道微生物中。我们进一步分析发现，P. copri在所有年龄段和65岁以下乳腺癌患者中的相对丰度和流行率也显著高于对照组。有趣的是，课题组更早发表的论文也表明乳腺癌荷瘤小鼠的肠道菌群也含有更高丰度的Prevotella属，提示P. copri的富集与乳腺癌的发生发展密切相关。
图1. 乳腺癌患者肠道菌群多样性有别于良性乳腺疾病患者，且其中P. copri异常富集，提示P. copri的富集与乳腺癌的发生发展密切相关
基于上述临床分析结果，课题组进一步观察P. copri属对乳腺癌发展的具体作用。课题组分别在无特定病原体(Specific pathogen-free，SPF)小鼠和无菌(Germ-free，GF)小鼠中构建4T1乳腺癌模型，观察灌胃给予P. copri(2.5×109cfu/mouse，每周1次)对肿瘤组织生长的影响。结果发现，无论在SPF小鼠还是GF小鼠中，灌胃给予P. copri均可显著促进4T1细胞形成的肿瘤的生长，其肿瘤生长速度、最终瘤重均显著提高，且最终P. copri在SPF小鼠粪便和小肠内容物的微生物中的残余比例更高，更在GF小鼠粪便微生物中占据绝对地位。
图2. 过量P. copri的定植可促进乳腺癌荷瘤小鼠的肿瘤组织生长
然而有趣的是，课题组发现P. copri的分泌物无法直接促进乳腺癌细胞生长。但我们通过靶向代谢组学分析发现，通过灌胃给予P. copri使其在宿主体内过量定植，可使SPF荷瘤小鼠和GF荷瘤小鼠血清中吲哚-3-丙酮酸（Indole-3-pyruvic acid，IPyA）急剧降低，且下降幅度最大，同时其前体色氨酸(Tryptophan，Trp)也在SPF小鼠中显著下降。Trp是人体无法自身合成的必须氨基酸之一，在人体内其主要由肠道微生物中的色氨酸羟化酶(Tryptophan hydroxylases，Tph)代谢为IPyA。课题组通过体外实验证明，P. copri可大量代谢Trp而生成极少量的IPyA。同时，我们通过动物实验证明，灌胃给予IPyA（120mg/kg，每天1次）可以明显抑制SPF荷瘤动物的肿瘤生长。上述结果表明，P. copri促进乳腺癌生长的过程中伴随着宿主体内IPyA的剧减，提示我们P. copri的过量定植可耗竭宿主IPyA，从而显著削弱宿主抑制乳腺癌细胞生长的能力，促进乳腺癌生长。
图3. P. copri的过量定植可耗竭宿主IPyA，从而显著削弱宿主抑制乳腺癌细胞生长的能力，促进乳腺癌生长
课题组进一步发现，在与生理浓度接近的实验浓度下（约2mM），IPyA对鼠源乳腺癌细胞株4T1有直接细胞毒作用，抑制其增殖和克隆形成能力。此前，课题组通过蛋白组学和简并代表性亚硫酸氢盐测序技术(Reduced representation bisulfite sequencing，RRBS)发现P. copri使肿瘤组织的变化集中在UHRF1调控的AMPK通路上。另一方面，在IPyA诱导乳腺癌细胞死亡的过程中，IPyA可使细胞中UHRF1，DMMT3A和DNMT1表达下调，促进AMPK磷酸化。IPyA也对细胞中AMPK通路相关基因mRNA水平产生影响，其中使cftr的mRNA水平下调，而使pfkfb3, pparg, scd1和lepr的mRNA水平上调。此外，我们还发现cftr的启动子区域的甲基化水平被IPyA上调，与其mRNA水平下调的情况相互吻合。
图4. IPyA对乳腺癌细胞有直接细胞毒作用
Xu等（Cell Res, 2022. 32(1): 54-71，doi：10.1038/s41422-021-00565-y）发现UHRF1是AMPK活性的关键负调控因子。在本课题中，我们发现IPyA抑制了UHRF1和PP2A C的核内分布，同时提高了细胞总体的AMPK磷酸化水平，与Xu等的发现相符。此外，我们还发现IPyA在促进细胞内AMPK磷酸化的同时，线粒体磷酸化（Mitochondrial oxidative phosphorylation）途径生成的ATP（mitoATP）和糖酵解（Glycosis）途径生成的ATP（glyATP）均大量减少，导致细胞总ATP生成急剧下降；同时，mitoATP的占比明显下降而glyATP占比明显上升，这些正是AMPK被激活的表现。综上所述，IPyA可通过逆转UHRF1介导的负调节，激活AMPK，对癌细胞进行能量代谢重编程，抑制细胞能量生成，从而抑制细胞增殖。最后，课题组在另一个鼠源乳腺癌系中再次验证了P. copri的促癌作用和IPyA的抑癌作用。以上结果表明，IPyA对肿瘤细胞的细胞毒作用与P. copri对乳腺癌促进作用完全相反。此前已经证明P. copri的增多导致了IPyA耗竭，这正是P. copri促进乳腺癌进展的关键原因。
图5. IPyA可通过逆转UHRF1介导的负调节，激活AMPK，对癌细胞进行能量代谢重编程，抑制细胞能量生成，从而抑制细胞增殖
图6. P. copri的促癌作用和IPyA的抑癌作用在另一个鼠源乳腺癌细胞系EMT-6中再次得到验证
本研究获国家自然科学基金（青年基金项目和面上项目）、福建省自然科学基金、佛山市科技局、佛山市登峰计划资助。
参考文献：
[1]Su, J., et al. (2024). Prevotella copri exhausts intrinsic indole-3-pyruvic acid in the host to promote breast cancer progression: Inactivation of AMPK via UHRF1-mediated negative regulation. Gut Microbes, 2024. 16(1): 2347757.
[2]Xu, X., et al. (2022). Nuclear UHRF1 is a gate-keeper of cellular AMPK activity and function. Cell Res 32(1): 54-71.
供稿：苏冀彦副研究员
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