FITC-xtra 异硫氰酸荧光素具有与FITC几乎相同光谱特性，温和缀合条件下比FITC的缀合产率高。在相同条件下，FITC-xtra抗体缀合物提供比FITC标记的缀合物的信号/背景比高得多。

图1.将HeLa细胞与带有(Tubulin+)或不带有(Tubulin-)的小鼠抗微管蛋白抗体以及生物素化的山羊抗小鼠IgG孵育，然后分别用FITC-Xtra链霉亲和素偶联物（绿色，左）或FITC-链霉亲和素偶联物（绿色，右）染色。细胞核用Hoechst 33342（蓝色，Cat#17530）染色。

FITC-xtra 异硫氰酸荧光素适用范围

用于标记蛋白质

FITC-xtra 异硫氰酸荧光素优势

1.光稳定性好

2.荧光不受pH（4-10）影响

FITC-xtra 异硫氰酸荧光素实验方案

（该标记方案适用山羊抗小鼠IgG与FITC-xtra的偶联物）

准备蛋白质储备溶液（溶液A）

将100μL反应缓冲液（例如，1M碳酸钠溶液或pH~9.0的1M磷酸盐缓冲液，）与900μL目标蛋白溶液（例如抗体，蛋白质浓度> 2 mg / ml）混合，得到1 mL蛋白标记储备液。 

注：1.蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0，则使用1M碳酸氢钠溶液或1M pH 9.0磷酸盐缓冲液，将pH调节至8.0-9.0的范围。 

       2.应将蛋白质溶于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）。 
       3.不纯的抗体、牛血清蛋白（BSA）和明胶稳定的抗体不能很好的被标记。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳汞，以获得标记结果。 
       4.如果蛋白质浓度小于2mg / mL，偶联效率明显降低。为获得好的标记效率，建议蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。

准备染料储备溶液（溶液B）

将无水DMSO加入到FITC-xtra小瓶中以制备10-20mM储备溶液，通过移液或涡旋混合均匀。 

注：在开始缀合之前准备染料储备溶液（溶液B）随配随用，保证使用的溶液的新鲜。染料储备溶液的长期储存可降低染料活性。溶液B可以在不受光照和潮湿的情况下储存在冰箱中两周。

准备所需的蛋白质缀合物 

注：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。我们建议您通过使用连续不同量的标记染料溶液重复步骤4和5来实验确定染料/蛋白质比率。通常，对于大多数染料 - 蛋白质缀合物，推荐使用4-6种染料/蛋白质。

1.使用10：1摩尔比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）作为起始点：将5μl染料储备溶液（溶液B，假设染料储备溶液为10 mM）加入到蛋白质的小瓶中溶液（95μl溶液A），有效摇动。假设蛋白质浓度为10mg / mL并且蛋白质的分子量为~200KD，蛋白质的浓度为~0.05mM。 
注意：蛋白质溶液中DMSO的浓度应<10％。

2.进行缀合反应。在有效摇动下将适量的染料储备溶液（溶液B）加入到蛋白质溶液（溶液A）的小瓶中。继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。

3.重复＃3.2，溶液B /溶液A的摩尔比为5：1; 如果需要，分别为15：1和20：1。

4.使用预制的旋转柱或其他技术纯化所需的缀合物。

5.计算上述4种缀合物的染料/蛋白质比（DOS）。