蛋白免疫印迹杂交（Western Blot WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。其中的步骤包括蛋白样本提取制备，蛋白定量，电泳，转膜与显色。

凯基公司根据客户的需求最新推出凯基蛋白提取和SDS PAGE凝胶电泳试剂盒（KGP113）和凯基western blotting 检测试剂盒 (KGP1201和KGP1202)两个western检测的组装试剂盒，客户只需准备好样本、一抗和显影等试剂，就可轻松完成整个western的操作流程，再也不用操心western过程中某种试剂的缺失问题。

    下图就是采用KGP113和KGP1201试剂盒检测一个药物的干预后细胞中Bcl-2的表达量。

    凯基公司同时还向客户提供Western blotting过程中每个环节所需的试剂。

一、             蛋白样本提取制备

凯基的蛋白提取试剂盒包括细胞裂解液、复合蛋白酶抑制剂、复合磷酸酶抑制剂等，除常规的EDTA、EGTA、Sodium orthovanadate、Sodium fluoride、Leupeptin、Pepstatin A、Aprotinin和PMSF，等组份之外，还添加了E-64 Protease、Cantharidin和α-phenauthrolire等蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，可以更有效地抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用，使客户提取的蛋白无降解的后顾之忧。Lysis buffer中由复合表面活性剂组成，含有非离子型和两性离子型表面活性剂，能很大程度提高蛋白提取的效率。全蛋白抽提试剂盒获得的全蛋白可用于Western Blot、免疫共沉淀等后续研究，但不能用于蛋白激酶的研究。核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒可同时获得样本的核蛋白和胞浆蛋白，提取的蛋白可用于进一步的转录因子活性分析、凝胶阻滞实验(gel shift assay)、免疫共沉淀、Western Blotting。膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒可同时获得样本的膜蛋白和胞浆蛋白，其中的膜蛋白包括不仅含细胞膜蛋白，也含胞器质膜蛋白，可用于PAGE电泳、 Western Blot、免疫共沉淀等后续研究。

除了上述的细胞和组织样品的蛋白提取，凯基公司还推出了细菌、酵母、植物蛋白抽提试剂盒和细胞亚组份蛋白抽提试剂盒。

KeyGEN公司最新推出简便型用蛋白提取的各种细胞裂解液，包括蛋白提取的常规去污剂和抑制剂，如：NP-40 、EDTA、EGTA、Sodium orthovanadate、Sodium fluoride、Leupeptin、Pepstatin A和Aprotinin，可用于常规WB的细胞裂解提取蛋白，操作步骤简便，经济实用。

二、             蛋白定量

凯基的蛋白定量试剂盒包括Braford蛋白含量检测试剂盒、BCA蛋白含量检测试剂盒和Lowry法蛋白

含量检测试剂盒三个系列，使客户在电泳前做到心中有数。根据组织细胞裂解或匀浆所使用的方法及裂解液的不同选用，因为去垢剂和还原剂等对不同蛋白浓度测定方法的影响差别很大。如使用凯基公司生产的蛋白提取试剂盒或者裂解液，建议使用凯基BCA蛋白浓度测定试剂盒。

三、             电泳

凯基公司为您准备了所有电泳的试剂，包括上样buffer，SDS-PAGE配胶试剂盒，电泳buffer、蛋白

Marker和蛋白染色试剂盒。

第一步：根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度进行凝胶的配制，可以使用凯基SDS-PAGE凝胶配制试剂盒

第二步：进行蛋白变性，样品先置95℃的水浴加热5分钟，接着置冰浴中5分钟，10000g离心20分钟，取上清液（样品可立即使用也可以分装冻存，-20℃可稳定保持数月）。蛋白上样缓冲液可以使用凯基SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)

第三步依次加入预染蛋白质分子量标准和待分析样品。（加样时间要尽量短，以

免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。样品一般在0.75mm厚的胶 加样30-50ug/lane)。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准，如凯基预染蛋白分子量 Marker和预染彩色蛋白分子量 Marker。

   第四步：电泳。加样完毕，选择适当的电压进行电泳。电泳时通常在浓缩胶时使用低

电压恒压电泳（40V/cm），而在溴酚蓝进入分离胶时使用高电压恒压电泳（80V、cm）。电

泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳。

四、             转膜与显色

电泳结束后，需进行转膜，一抗的孵育和洗涤，二抗的孵育和洗涤，最后进行显色。

1、   转膜：转膜可以采用PVDF膜。转膜电泳缓冲液可以使用凯基电转移缓冲液(10×)。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。

2、   膜的封闭(Blocking)

转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的WB洗涤液中，漂洗1～2分钟，以洗去膜上的转膜液。用巴斯特吸管吸尽洗涤液，加入WB封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟或4℃ 封闭过夜。

3、一抗孵育

参考一抗的说明书，按比例用WB一抗稀释液适当稀释一抗。用巴斯特吸管吸尽封闭液，不要漂洗，直接加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。加入WB洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5～10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，漂洗3～5次，每次5～10分钟。如果结果背景较高可以适当延长漂洗时间并增加漂洗次数。

4、参考二抗的说明书，按照适当比例用WB二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。用巴斯特吸管吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。加入WB洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5～10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，漂洗3～5次，每次5～10分钟。如果显色结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

5、   ECL化学发光检测，可以采用凯基 ECL 检测试剂盒

凯基公司向客户提供常用的内参一抗和常用二抗，全部是进口分装。

同时凯基公司还提供各种磷酸化和非磷酸化一抗，具体请详见公司网址：http://www.keygentec.com.cn