简介
Calcein AM是一种疏水性化合物，可以很容易地渗透到完整的活细胞中。 它广泛用于细胞活力测定。 通过细胞内酯酶水解非荧光钙黄绿素AM产生强荧光的亲水钙黄绿素，其在细胞质中良好保留。 酯酶活性与活细胞数成正比，因此与荧光强度直接相关钙黄绿素产生自酯酶催化的钙黄绿素AM水解。 Calcein AM是用于标记和监测活细胞细胞功能的最流行的荧光探针之一。 然而，Calcein AM的单色使得在多色应用中不可能使用这种有价值的试剂。 例如，由于钙黄绿素AM具有与GFP相同的颜色，因此不可能将钙黄绿素AM与GFP转染的细胞组合使用。
光谱特性
为了解决上述Calcein AM的颜色限制，我们开发了Calcein Orange™和Calcein Red™。 这两种新的Calcein AM类似物与Calcein AM结合使用，可以对活细胞进行多色标记和功能分析。 此外，我们还开发了CytoCalcein™Violet 450，CytoCalcein™Violet 500，CytoCalcein™Blue 550和CytoCalcein™Blue 600，用于流式细胞仪应用。 CytoCalcein™染料与Calcein具有相似的生物学特性，它们针对各种流式细胞仪的激发波长进行了优化，为活细胞的流式细胞分析提供了额外的颜色。 CytoCalcein™Violet 450和CytoCalcein™Violet 500被紫激光（405 nm）激发，并分别在450 nm和500 nm发出荧光。 CytoCalcein™Blue 550和CytoCalcein™Blue 550被蓝色激光（488 nm）激发，并分别在550 nm和600 nm处发出荧光。
表1.细胞活力检测试剂的光谱特性
使用细胞活力指标AM酯类
AM酯是非极性酯，其易于穿过活细胞膜，并且通过活细胞内的细胞酯酶快速水解。 AM酯广泛用于非侵入性地将各种极性荧光探针加载到活细胞中。 但是，使用AM酯时必须小心，因为它们易于水解，特别是在溶液中。 它们应在使用前重新配制优质无水二甲基亚砜（DMSO）。 DMSO储备溶液可以在-20℃下干燥储存并避光。 在这些条件下，AM酯应稳定数月。
以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。 该步骤仅提供指南，应根据您的特定需求进行修改。
a）在高质量无水DMSO中制备2至5mM AM酯的储备溶液。非离子的洗涤剂Pluronic®F-127有时用于增加AM酯的水溶性。
注意：可将等体积的20％Pluronic®F-127溶液添加到DMSO储备溶液中细胞活力指示剂在稀释到上样缓冲液之前。最终的Pluronic®F-127
浓度约为0.02％。各种Pluronic®F-127解决方案可从AAT获取
注意：不建议在Pluronic®F-127存在下长期储存AM酯。
b）在实验当天，要么在DMSO中溶解细胞活力的固体指标，要么溶解细胞活力将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。准备一个有效的解决方案在您选择的缓冲液中1至10μM（如Hanks和Hepes缓冲液）。对于大多数细胞建议最终浓度范围为4至5μM的细胞活力指标。细胞加载所需指标的确切浓度必须根据经验确定。
c）如果您的细胞含有有机阴离子转运蛋白，丙磺舒（1-2.5 mM）或磺吡酮可以向细胞培养基中加入（0.1-0.25mM）以减少脱酯化指示剂的泄漏。在室温或37℃下将细胞与AM酯孵育20分钟至1小时。
注意：降低加载温度可能会降低指示器的划分。
d）在细胞活力指示剂缓冲液（含有阴离子转运蛋白抑制剂，如果适用）中洗涤细胞以除去过量的探针。
注意：通过流式细胞术立即分析细胞样品，以确定零时间的每个细胞的平均荧光而不洗涤。
e）在所需的Ex / Em波长下进行实验（见表1）。
储存条件：
储存于-20°C，避光。 到期日为自收到之日起6个月。
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